LINHAS DE PESQUISA
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1. Caracterização de proteases e seus inibidores.
1.1. BTCI (professora Sonia Freitas)
Dentre os inibidores, destacamos um derivado de planta da família Bowman-Birk (veja na imagem abaixo) e outro encontrado em toxina de escorpião de família desconhecida. O BTCI de Vigna unguiculata inibe o proteassoma e está sendo testado contra alguns tipos de câncer. Para as proteases que já possuem estrutura a ideia é executar experimentos de varredura de fragmentos para tentar obter possíveis moléculas inibidoras ou complexa-las aos inibidores mencionados ou peptídeos derivados destes para definir o modo de ligação/inibição.
Complexo ternário: BTCI (ao centro, em verde opaco) inibindo simultaneamente uma tripsina (azul) e quimotripsina (vermelho e verde)
1.2. Fitocistatinas (professor Napoleão Valadares)
Cistatinas são proteínas que atuam como inibidores de cisteíno proteases, regulando a atividade dessas proteases. Fitocistatinas estão presentes em plantas e participam em diversos processos fisiológicos normais, como a regulação do amadurecimento de frutos ou o envelhecimento das folhas, mas também podem agir inibindo proteases de outros organismos, como fungos e insetos, atuando como uma linha de defesa da planta.
Uma característica peculiar das fitocistatinas é a ocorrência do fenômeno de troca de domínios (veja na imagem abaixo), um mecanismo de dimerização que abole a atividade inibitória das cistatinas. Em resumo, na forma monomérica as moléculas da cistatina são capazes de inibir cisteíno proteases, mas na forma dimérica perdem totalmente essa atividade. A dimerização por troca de domínios é uma forma pouco estudada da regulação da atividade das proteases. Nosso laboratório trabalha intensamente na caracterização biofísica e resolução de estruturas cristalográficas de fitocistatinas visando compreender as bases moleculares da troca de domínios.
1.3. Proteases virais (professor João Alexandre)
Os arbovírus (arthropod-borne virus) são uma classificação que compreende grupos virais cuja transmissão é realizada por vetores artrópodes infectando vertebrados, sendo na sua grande maioria vírus de RNA. Dentre esses, alguns arbovírus tem se mostrado de grande relevância, devido ao grande número de casos, como o vírus da dengue (DENV) e o zika (ZIKV), pertencentes a família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, o chikungunya (CHIK) e o mayaro (MAYV), família Togaviridae e gênero Alphavirus. Todos estes carecem de estudos estruturais mais aprofundados objetivando tanto um maior conhecimento da sua biologia molecular e também visando a busca para novos fármacos. Dentre as possíveis proteínas alvo, as proteases virais têm se mostrado excelentes candidatos. Estas proteínas (NS3 nos Flavivirus e nsP2 nos Alphavirus) possuem a função de clivar determinadas regiões da poliproteína viral sendo de vital importância para a replicação. A NS3, presente nos vírus DENV e ZIKV, apresenta juntamente com o domínio serino protease, na posição N-terminal, uma região de linker e o C-terminal com a função de RNA helicase, podendo essa última região ser dividida em subdomínios com uma helicase dependente de ATP e uma RNA trifosfatase. Além disso, para que a proteína fique ativa é necessário também uma ligação não covalente com uma região da NS2B, outra proteína que compõe o vírus. Por sua vez, a protease nsP2, presente nos vírus CHIK e MAYV apresenta um conjunto de domínios semelhantes a NS3, possuindo domínios de RNA helicase, nucleosídeo-trifosfatase e uma RNA trifosfatase, entretanto a região da protease, ao contrário da NS3, se localiza na porção C-terminal. Estudos estruturais da nsP2 de CHIK parecem indicar uma díade com a possibilidade de manter a atividade mesmo após a mutação da cisteína, o que ocorre através de uma serina localizada próximo ao sítio ativo, ou seja, essa proteína apresentaria uma díade catalítica intercambiável, cys-his ou ser-his. O presente trabalho visa realizar estudos estruturais das proteases dos arbovírus Dengue, Zika, Chikungunya e Mayaro através de ferramentas in vitro e in silico, com perspectivas de utilizar os dados para o desenho de inibidores virais.
Covid-19
1.4. Evolução de proteases (professor João Alexandre)
As tripsinas são serino proteases, ou seja, enzimas que utilizam um resíduo ativado de serina para a hidrólise de ligações peptídicas, especificamente após resíduos carregados positivamente (arginina e lisina). São enzimas amplamente presentes em metazoários, onde atuam nos processos digestivos, hidrolisando o alimento proteico ingerido. Dentre os clados animais, as tripsinas apresentam uma grande variação quanto às suas propriedades cinéticas e sua estrutura tridimensional.
Com o intuito de compreender como ocorreu a evolução estrutural e funcional de tais enzimas, propomos, em nosso laboratório, um estudo acerca das proteínas ancestrais que deram origem às diferentes tripsinas encontradas hoje. Para isso utilizamos a técnica de ASR (Ancestral Sequence Reconstruction) onde, a partir de um estudo filogenético das proteínas atuais, é possível inferir a provável sequência das tripsinas ancestrais. Com a sequência em mãos, desenhamos genes destas proteínas ancestrais para produzir as enzimas de maneira heteróloga e estuda-las funcional e estruturalmente.
2. Enzimas de fungos patogênicos (professor João Alexandre)
Vários fungos são patógenos humanos e possuem relevância médica, como por exemplo as espécies de Cryptococcus, Candida, Aspergillus e Pneumocystis responsáveis por mais de 90 % de todas as mortes causadas por fungos. As doenças causadas por estes fungos têm crescido significativamente em todo o mundo, representando sério problema de saúde pública. Atualmente as opções terapêuticas disponíveis limitam-se a quatro grupos de antifúngicos, alguns causam sérios efeitos adversos ao paciente. Além disso, tem-se observado surgimento de resistência dos patógenos aos antifúngicos clássicos, sendo necessário o desenvolvimento de novas drogas. Visamos o desenvolvimento de terapêuticas que possam ser eficazes e menos tóxicas ao paciente.
A via de biossíntese do ergosterol é altamente conservada entre os fungos. O ergosterol é um lipídio essencial para a viabilidade fúngica pois é responsável pela fluidez e permeabilidade da membrana. O colesterol e o ergosterol compartilham a mesma via de biossíntese até a etapa de produção de zimosterol, a partir deste ponto se diferenciam e utilizam enzimas distintas até o final das vias. Para a síntese de ergosterol, o zimosterol é convertido a fecosterol pela enzima SMT, uma esterol C-24 metiltransferase que atua adicionando um grupo metil ao carbono 24. A SMT tem sido importante alvo de fármacos, uma vez que o gene ERG6, responsável por codificar a SMT, está ausente do genoma humano. O foco do nosso laboratório nesse projeto está na resolução das estruturas cristalográficas das SMTs de Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Coccidioides imitis, Cryptococcus neoformans, Pneumocystis jiroveci e Paracoccidioides lutzii, além de realizar a caracterização biofísica e enzimática visando ter uma compreensão mais elaborada das propriedades catalíticas e estruturais essenciais para o desenvolvimento de inibidores fúngicos específicos.
A proteína KRE2 / MNT1 pertence a uma classe de enzimas envolvidas na biossíntese de glicoproteínas de parede celular sendo altamente conservada em fungos patogênicos de importância médica, como por exemplo nos gêneros Candida spp., Cryptococcus spp., e Paracoccidioides spp., entre outros. É importante para viabilidade celular e virulência do patógeno no interior do hospedeiro, não possuindo genes homólogos em humanos ou eucariotos superiores. Buscando contribuir com o desenvolvimento de novos fármacos ou terapêuticas, recursos computacionais têm sido aplicados como estratégia para seleção de fármacos e/ou compostos similares a um inibidor conhecido da proteína KRE2, sendo esta metodologia denominada como drug repositioning (DR). O DR computacional tem sido muito utilizado pela indústria farmacêutica na descoberta de novas indicações terapêuticas para fármacos de uso comercial, diminuindo tanto o tempo e custos da pesquisa, como os riscos ao paciente, além de ser rentável financeiramente. Em 2013, este método representou 30 % dos fármacos e vacinas aprovadas pelo FDA. A pesquisa é desenvolvida com participação de laboratórios do Lorraine Research Laboratory in Computer Science and its Applications (LORIA, França) e da Universidade Católica de Brasília.
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3. Septinas (professor Napoleão Valadares)
Septinas formam uma família conservada de GTPases que se associam formando filamentos e são encontradas em células de fungos a animais. Essas proteínas são responsáveis por diversos processos celulares, e apresentam um papel em doenças neurodegenerativas e em alguns tipos de câncer. Estudos estruturais de septinas são difíceis de serem executados por uma variedade de razões, incluindo a presença de regiões ou domínios intrinsicamente desordenados e a automontagem de filamentos in vitro que leva a formação de oligômeros e a precipitação.
Em nosso laboratório, propomos uma abordagem estrutural para o estudo das regiões C-terminais das septinas humanas, visando contornar algumas das dificuldades encontradas na resolução de estruturas cristalográficas.
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